北京普乐海生物科技有限公司

市面上有的TOPO克隆载体为什么是氨苄/卡那双抗性，是必须的吗？TOPO克隆载体必须搭配特定的感受态细胞吗？自制的感受态为什么不能用？长片段连接，TOPO载体效率为什么低？

普乐海带您揭开双抗性TOPO载体的秘密！普乐海“瞬连”第三代TOPO载体，更小的载体，仅1.8kb，容纳更长片段，转化效率更高，可兼容自制感受态，让克隆连接更方便，更简单！

1.氨苄（Amp）/卡那（Kana）双抗性TOPO载体的开发历史

以前TA克隆市场占有率极高的是Promega的pGEM-T载体和Takara的pMD18-T载体。这些载体采用传统T4连接酶连接，全部是Amp单抗性的。由此可见氨苄单抗筛选方式没有问题，而某公司公司鼓吹双抗是筛选必须的。Topo异构酶工作原理决定TOPO载体并不需要双抗才能用，双抗性只能是在一个很狭窄的范围内有少量需求。15年前第一代商品化topo载体是Invitrogen购买了专利授权后开发的，其中有一个最著名的topo载体pCR 2.1-TOPO，这是双抗性的topo载体。某公司作为国内第一个TOPO载体研发者，最简单的办法是原封不动把载体拿过来，当然也把重大缺陷（回头解释为啥是缺陷）也拷贝过来了。比较Invitrogen和某公司的载体构造，就会明白什么问题。

2.Invitrogen设计氨苄（Amp）/卡那（Kana）双抗性TOPO载体的原因

普通PCR产物克隆载体完全用不到双抗性，为啥Invitrogen设计双抗性TOPO载体呢？可能是Invitrogen的载体系统很多，其中著名的Gateway系统里面有很多载体是Amp抗性和Kana抗性的。为了方便在在各个系统中穿梭通用，也就沿用了双抗性设计。某公司把双抗性设计完全照搬照抄过来了，殊不知还有不良影响。

3.氨苄（Amp）/卡那（Kana）双抗性TOPO载体存在明显的缺点

双抗性设计增加了卡那抗性序列，载体大小至少增加了1kb，造成以下三个缺点：

●载体越小可容纳的插入片段越大，载体越大能容纳的插入片段就越小。某公司TOPO载体有3.9kb，比普乐海1.8kb大了一倍多。大的载体能容纳的片段就要比小载体短一些，也就是说我们的载体能连接更长的片段。

●后续转化感受态细胞，质粒大小和转化效率成“指数级”反比，越小的质粒越容易转化（钻进去）。比如，0.5kb片段，普乐海载体+插入片段大小是2.3kb，某公司是4.4kb， 2.3kb比4.4kb的转化效率大了不是一倍，而是比某公司高几倍。

●卡那抗性转化后需要复苏1个小时；而Amp抗性可以不复苏，立刻涂平板，快很多。

双抗性极少情况下会用到，卡那抗性的唯一优点是不会长卫星菌落：生长超过比如12小时，甚至15小时的时候，也不会长卫星菌落。Amp抗性生长久了（>12小时）， 容易长卫星菌落。AMP抗性是全世界使用最广泛的抗性，对比卡那不容易长卫星菌落的唯一优点，卡那抗性的缺点复苏时间比Amp抗性复苏要长1个小时，大家觉得应该选哪种抗性？

总之，双抗性只是一个噱头，Amp单抗性完全足够，莫要再被某公司忽悠了！

4.普乐海“瞬连” 新一代TOPO载体连接速度更快，转化效率更高

为了避免双抗性设计的不良影响，我们设计全新的“瞬连”第三代TOPO载体。

●去掉卡那抗性序列和其他非必须质粒元件，剩复制子和Amp抗性（这两个是质粒生存必须）。全长仅仅1.85kb，是国内最小的TOPO载体。

●连接效果显著：可以不用复苏，比某公司的卡那抗性60分钟大为缩短。载体特别小，能连接的片段更长，而且转化效率是比某公司的10-100倍。

●因为某公司的载体大，转化效率低，只能用特殊配带的感受态细胞才能保证转化效率，而客户自己制备的感受态细胞效率很低，无形中加大了客户的成本。

●普乐海新一代单抗性TOPO载体任何一个指标都超过某公司，市场份额越来越大。普乐海TOPO载体价格只有市面上T公司同类产品一半不到，此外，我们是10ul体系20次，等于某公司的40次（T公司20次是按照5ul体系算）。

TOPO载体克隆注意事项：

●确保PCR片段和TOPO载体完全匹配：平末端还是粘性末端？

●一定要做胶回收，排除引物二聚体的影响！

●一定要做产物的定量，确定载体和产物的比例！

●越长的片段连接效率越低：按标准转化流程！

●做正对照，确保载体/感受态细胞没有问题！

●感受态细胞的效率很重要：用新制备或者外购的高效感受态！

●注意：我们的载体只能用M13正向引物，和反向引物做菌落PCR/测序，不能用M13(-47),M13(-48)引物做菌落PCR/测序！