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拓扑异构酶简介 
–TOPO克隆载体利用了DNA拓扑异构酶I，加快了PCR克隆 。拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。  
TOPO克隆原理 

TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。牛痘（Vaccinia） 病毒拓扑异构酶 Ⅰ 可以结合在双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5’-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键（cleave the phosphodiester backbone），释放出的能量可催化 DNA 切口处的 3' 磷酸基团与拓扑异构酶 的第 274 位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处 5' 羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键，重新将 DNA 连接起来。 pCR-TOPO 载体就是根据拓扑异构酶 Ⅰ 的这一性质来开发的， pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3'末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3' 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。